手性藥物的常用分離分析技術介紹
時間:2019-03-06
作者:聯創生物醫藥信息部
原創： 淳允 行舟Drug
手性藥物(chiral drug)是指分子立體結構和它的鏡像彼此不能夠重合的一類藥物，將互為鏡像關系而又不能重合的一對藥物結構稱為對映體 (enantiomer)。對映體各有不同的旋光方向：左旋、右旋、外消旋，分別用(-)、(+)、(±)符號表示。藥物分子的手性標記通常采用 R/S 標記法，對于氨基酸、肽類、糖類、環多元醇及其衍生物的立體命名，也用 D、L 或俗名表示。
隨著人們對手性藥物認識的不斷深入和不對稱合成技術、拆分技術的迅猛發展，手性藥物的市場逐年擴大，世界醫藥領域正興起一股開發手性藥物的熱潮。各國政府和各大醫藥公司、科研機構紛紛投入巨資，在手性藥物制劑、手性原材料和手性中間體等領域進行研究開發，搶占世界手性藥物市場，并在抗病毒藥物、心血管藥物、基因工程藥物、抗腫瘤藥物等方面的研究取得了豐碩成果?，F就手性藥物的常用分離分析方法作一簡述。
現代分離分析技術在對映體的分離與測定方面顯示出巨大的優越性。常用的手性藥物測定技術有高效液相色譜(HPLC)、氣相色譜(GC)、超臨界流體色譜(SFC)、毛細管電泳(CE)等。這些手性色譜技術集分離與測定于一體，可實現對映體的快速定性、定量分析甚至少量制備。
即以現代HPLC技術為基礎，引入不對稱中心來實現對映體的拆分，分為間接法和直接法。
直接法，即手性流動相添加劑法（CMPA）和手性固定相法(CSP)，前者是將手性選擇劑添加到流動相中，利用手性選擇劑與藥物消旋體中各對映體結合的穩定常數不同，以及藥物與結合物在固定相上分配的差異，實現對映體的分離；后者則是由具有光學活性的單體固定在硅膠或其它聚合物上制成的，在拆分中CSP直接與對映體相互作用，而其中一個生成具有不穩定的短暫的對映體復合物，造成在色譜柱內保留時間的不同，從而達到分離的目的。直接法的優點在于：不需對樣品進行衍生化，可采用普通的色譜柱，手性添加劑可流出，也可更換，同時添加物的可變范圍較寬，使用比較方便。目前常用的手性流動相添加劑有：環糊精(CD)及其衍生物、配位基手性選擇劑、手性離子對添加劑、蛋白質、大分子抗生素。CMPA可以拆分多種手性藥物如氨基酸及其衍生物類藥、巴比妥類藥物、受體阻滯藥、去甲腎上腺素藥等。
例如：CSP法分離鹽酸普萘洛爾
propranolol
分離條件：色譜柱：Chiral-AGP（100 mm×4.0 mm）；流動相：0.5%異丙醇的20mM醋酸銨緩沖液（pH 4.1）；流速1.0 mL/min；檢測波長：225 nm
間接法，即手性衍生化試劑法(CDR)，是將藥物對映體先與高光學純度衍生化試劑(CDR)反應形成非對映異構體，再進行色譜分離測定。此法主要適用于不宜直接拆分測定的化合物如手性脂肪胺類、醇類等。該法的優點是衍生化后可用通用的非手性柱分離，無需使用價格昂貴的手性柱，而且可選擇衍生化試劑引入發色團提高檢測靈敏度，分離效果好，分離條件簡便。但對手性衍生試劑的要求較高，操作比較麻煩，多在其他方法無法實現時才采用。
氣相色譜法是較早用來進行對映體分離的一種分離色譜方法。一般地說，它速度快、簡單、靈敏，在分離對映體時，其分離度重復性和精度都很高，對于可揮發的熱穩定手性分子，它表現出了明顯的優勢。
GC手性固定相按照拆分機制可分為三類：第一類是基于氫鍵作用的手性固定相，主要是氨基酸衍生物固定相，這類手性固定相中含有酰胺基或羧酸酯基，可以與手性藥物分子中的活潑基團通過氫鍵作用締合，形成非對映異構體締合物，由于立體因素和氫鍵作用的不同，所形成的非對映異構體締合物的穩定性也不同，導致對映體通過色譜柱所需時間不同而將它們分離開。第二類是基于配位作用的手性金屬配合物固定相。一般要求被分析物有π電子或孤對電子，分離機制主要基于π鍵的相互作用，可以用來拆分低沸點手性化合物如烯、醇、醚、酮、酯以及昆蟲信息素和香精油等。第三類是基于包含作用的環糊精衍生物固定相，這類固定相在GC手性分離研究中發展最快，其選擇性高，應用也廣。一般認為環糊精固定相的拆分機制是由于環糊精特殊的籠狀結構，可與對映體形成非對映的包含物而達到拆分的目的。盡管氣相色譜是開發得較早的一種分離對映體的色譜手段，但它存在著一些固有的局限性，如要求分析樣品具有一定的揮發性和熱穩定性。另外，氣相色譜要實現制備比較困難。
以GC法分離麝香酮為例[3]，見下圖：
色譜柱：Agilent CYCLODEX-B手性氣相毛細管柱（60 m×0.25 mm×0.25 μm）；載氣：H2（99.999％）；柱流量：0.3 mL·min-1；進樣口溫度：200 ℃；檢測器：FID；檢測器溫度：230 ℃；分流比：25∶1；進樣量：0.2 μL。
采用CO2等超臨界流體為流動相的超臨界或次臨界流體色譜兼備HPLC和GC的優點，可以使用HPLC和GC的各種檢測器進行分析和測定。在手性分離甚至制備方面有其獨特的應用。
SFC在手性藥物拆分中的優越性主要是由于超臨界流體的低黏度性質，與HPLC和GC相比，在相同的保留時間內，SFC的分離度更大、理論塔板數更高；在相同的分離度下，SFC的分離時間更短（見下圖）；有機溶劑的消耗量降低。
其中，SFC技術中所涉及的色譜柱類型與GC類似，毛細管柱的規格一般為內徑50 ~ 100 μm，柱長2.5 ~ 20 m，膜厚度在0.15 ~ 1.0 μm范圍。填充柱：一般則直接使用商品手性液相色譜柱，內徑為4.6 mm，柱長為150 ~ 250 mm。
SFC的手性固定相類型
常用的手性固定相有環糊精聚硅氧烷鍵合相、金屬配合物固定相、酰胺和氨基酸固定相、多糖類固定相等。
毛細管電泳手性分離是20世紀80年代以來新興的一種分離技術，這項技術為極性大、熱穩定性差和揮發性手性藥物的拆分提供了經濟有效的手段，因它操作簡單、運行成本低、分離效率高而被廣泛應用于藥物、生物、大分子、臨床醫學等領域。常用的手性選擇劑有環糊精、冠醚、手性混合膠束、手性纖維素、蛋白質、糖類、大環抗生素等。其中β-CD以其分子大小適中、價格便宜被廣泛應用，尤以衍生化的β-CD為最。目前，毛細管電泳分離方法的討論主要集中在各種手性添加劑與對映體藥物的匹配以及具體實驗中條件最優化選擇上。隨著各種具體方法的成熟，CE在現實中的應用也會更廣泛。
以CE同時分離2對三唑類藥物為例，分離度可以達到10以上，柱效高達70萬理論塔板數/米，見下圖：
分離條件：毛細管柱：未涂層石英毛細管(50 cm × 50 μm i.d.)；背景電解質：20 mM硼砂+ 40 mMCM-γ-CD+20 mM SDS，pH 9.0；進樣方式：重力進樣5s；分離電壓：20 kV；溫度：室溫；檢測波長：254 nm。
參考文獻
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[3] 張芳, 張霞, 劉春美, 吳薛明, 手性GC法測定麝香中麝香酮的含量, 中國藥房, (2011) 4089-4091.
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[5] 李偉東, 蔡寶昌, 毛細管電泳法在手性藥物分離中的應用, 世界科學技術:中醫藥現代化, 7 (2005) 47-51.
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